BECKMAN DNA DİZİ ANALİZ SİSTEMİ

beckman DNA dizi analizi

Biyoteknoloji Enstitüsü Merkez Laboratuarı Fonksiyonel Genomik birimleri genotipleme ve SNP analizi için gerekli altyapıya sahiptir. Yalnızca DNA izolasyonuna ayrılmış bir oda ve yalnızca PCR reaksiyonlarının gerçekleştirilmesi için ayrılmış laminar air flow kabin ile kontaminasyon riski en aza indirilmiştir. Orta-Yüksek işlem hacimli çalışmaların yapılması laboratuar altyapısında bulunan otomatik pipetleme robot sistemi ile mümkün olmaktadır.

Birimimiz Beckman CEQ 8000 sekiz kapillerli otomatik genetik analiz platformunda DNA dizi analizi, fragment  analizlerini yürütmektedir.

A. DNA DİZİ ANALİZİ

Dizi analizleri Beckman DTCS kimyası ile gerçekleştirilmektedir. Örnekler 8 kapillerli otomatik DNA dizi analiz sistemi Beckman CEQ 8000 Genetic Analyzer sisteminde yürütülmektedir. Sistem yürütme ortamı olarak lineer poliakrilamid kullanmakta ve 100 dakikalık bir sürede %98’in üzerinde bir doğrulukla örnek başına 700 baz okuyabilmektedir.

DNA dizilerinin tanımlanması veya doğrulanması istenen plazmid, faj, cosmid, bac veya sağlaştırılmış PCR ürünlerinin dizi analizleri gerekli temizlik ve miktarda kalıp DNA ile uygun primer sağlandığı takdirde birimimiz tarafından gerçekleştirilebilmektedir.

a. Teslim Edilecek DNA Örnekleri ve Primerlerin Nitelik ve Miktarı

PCR ürünleri*:       100-200bp      10-20 ng/ml

200-500bp                    20-30 ng/ml

500-1000bp                  30-50 ng/ml

1000-2000bp                50-60 ng/ml

> 2000bp                     40-100 ng/ml

Plasmid:                  100-200 ng/ml

BAC:                           250 ng/ml

Reaksiyon başına 10ml kalıp DNA teslim edilmesi gerekmektedir.

Reaksiyon başına 10pmol/ml konsantrasyonda 10ml  toplam hacimde primer** DNA ile beraber ünitemize teslim edilmelidir.

* Saflaştırma kolon yöntemi ile olmalıdır. Bu amaçla Qiagen/Qiaquick, Promega/Wizard, MN veya benzeri kalitedeki kitler kullanılabilir. 200 bç’den küçük PCR ürünleri ekzonükleaz 1/SAP muamelesi ile saflaştırılmalıdır.

** Primerler HPLC ile saflaştırılmış olmalıdır. OPC (Metabion), HPSF (MWG) eşdeğeri bir saflaştırma metodu da yeterli saflıkta primerler vermektedir.

b. Birime Örneklerle Beraber Verilmesi Gereken Bilgiler

1. Dizilenmesi istenen kalıp DNA’nın %2 agaroz jeldeki görüntüsü ve istenen plazmid, faj, cosmid ve bac DNA’larının %1’lik agaroz jel profili, ise spektrofotometrik ölçüm sonuçları (konsantrasyon, A260/A280 ve A260/A230 oranları), birimimize DNA örneği ve primerlerle beraber teslim edilmelidir.

2. DNA dizi analiz reaksiyonlarında analiz edilen bölgenin baz içeriğine bağlı olarak yapılması gerekli optimizasyonlara imkan tanınabilmesi için bölgenin GC içerik oranı ve dizilemede kullanılacak primerin dizi bilgisinin, primerin sekans reaksiyonu için gerekli şartlara uygun olduğunun belirlenebilmesi için birimimize gerekli bilgi verilmelidir.

 

c. DNA Dizi Analiz Sonuçları

Sonuçlar birimimizde biriken isteklerin yoğunluğuna ve istenen analiz sayısına bağlı olmak üzere 1 hafta içinde istem yapana e-posta yoluyla veya posta ile yazılı veya CD’ye kayıtlı olarak teslim edilecektir.

B. FRAGMENT ANALİZİ

Mikrosatellit (STR, SSR) AFLP benzeri analizlere dayanan genotipleme çalışmaları birimimizde WellRed boyalarla işaretli PCR ürünlerinin Beckman CEQ 8000 Genetic Analyzer sisteminde yürütülüp incelenmesi ile gerçekleştirilir. Sistem otomatik allel tanımlamasını 400 bazda + 1 baz ve 600 bazda +2 baz çözünülürlükte gerçekleştirir.

a. Analiz Edilecek PCR Ürünleri

WellRed* işaretli PCR ürünü     50 ul

*WellRed işaretli primerler Proligo’dan (www.proligo.com) veya Invitrogen’den (www.invitrogen.com) sipariş edilebilir.

b. Birime Örneklerle Beraber Verilmesi Gereken Bilgiler

1. PCR ürününün %2’lik agaroz jel’deki profili örneklerle beraber teslim edilmelidir.

2. PCR ürününün uzunluğu belirtilmelidir.

3. Örneklere ilişkin birimimiz iletilen her türlü bilgi gizlilik esaslarına uygun olarak işleme konulacaktır.

4. Eksik bilgi veya örnek ve/veya primer nitelik ve niceliğinde gereken şartları sağlamaya analiz istekleri kabul edilmeyecektir.

c. Fragment Analiz Sonuçları

Sonuçlar örnek sayısına ve birimimizde biriken diğer isteklerin yoğunluğuna bağlı olarak ilgiliye e-posta veya posta ile (çıktı veya CD üzerinde) bir hafta içinde iletilecektir. Tohum tanısı ve tescil tasdiki durumunda bu süre 2 ile 4 hafta arasında uzayabilecektir.

This post is also available in: English