AFFYMETRİX MİKRODİZİN ANALİZİ

Genom boyunca SNP ve  ifade analizleri Merkez Laboratuarı Fonksiyonel Genomik birimlerinden Mikroarray biriminde Affymetrix GeneChip platformunda gerçekleştirilmektedir. GeneChip Mikroarrayler kaplanmış bir kuvartz yüzeyin belirli noktalarına kimyasal olarak sentezlenmiş DNA problarından oluşmaktadır. İşaretli nükleik asitler array’e hibridize edilir. Herbir prob bölgesine tutunmuş işaretli nükleik asit miktarı taranıp takip edilebilmektedir. Böylece yüzbinlerce hedef dizinin varlığının kesin tanımlanması (DNA analizi) veya gen aktivitesinin yansıması olarak onbinlerce RNA transkriptinin aynı anda nicelenmesi (ifade analizi) gerçekleştirilebilmektedir.

A. TRANSKRİPTOM PROFİLLEMESİ

Genom ölçeğinde ifade profillendirilmesi birimimiz tarafından yapılabilmektedir. Merkez laboratuarlarımızda bulunan Affymetrix Mikroarray Analiz sisteminde aşağıda listesi verilen organizmalara ait mikroarrayler mevcuttur.

Birimimizde genomunun ifade array çalışması gerçekleştirilen organizmaların listesi aşağıda verilmiştir:

Arabidopsis Genom Array

B. subtilis Genom Array (Antisense)

Barley Genom Array

Bovine Genom Array

C. elegans Genom Array

Canine Genom Array

Chicken Genom Array

Drosophila Genom Arrays

E. coli Genom Arrays

Human Genom Arrays

Maize Genom Array

Mouse Genom Arrays

P. aeruginosa Genom Array

Plasmodium/Anopheles Genom Array

Porcine Genom Array

Rat Genom Arrays

Rice Genom Array

S. aureus Genom Array

Soybean Genom Array

Sugar Cane Genom Array

Vitis vinifera Genom Array

Wheat Genom Array

Xenopus laevis Genom Array

Yeast Genom Arrays

Zebrafish Genom Array

a. Analiz Edilecek RNA Örneklerinin Asgari Nitelik ve Miktarı

RNA örneklerinin miktar, bütünlük ve temizlik dereceleri ifade profillemesi çalışmalarından alınacak sonuçların kalite ve güvenilirliği ile doğrudan ilişkilidir. Bu nedenle RNA örneklerinin değerlendirmelerinde birimimiz yalnız Agilent Bioanalyzer platformundan alınan sonuçlara itibar edecektir.

Bu analiz sonucunda degrade olmadığı görülen yeterli temizlik ve miktardaki RNA örnekleri işleme konulacaktır. Birimimize teslim edilecek RNA örneği 1-2 ug arası miktarda ve A260/A280 oranı 1.9-2.1, A260/A230 oranı ise 2-2.5 arası bir değerde olmalıdır.

Merkezimize kuru buz içinde getirilecek olan RNA örneklerinin Bioanalyzer’daki değerlendirmeleri istendiği takdirde yine birimimizde yapılabilir.

İstenen kalitede RNA örneği elde etmek için kullanılabilecek tekniklere ilişkin detaylı bilgi için birimimize başvurulabilir. Kullanılan RNA izolasyon metodu ne olursa olsun izolasyon aşamalarına örnekteki DNA kontaminasyonunu ortadan kaldırmak üzere DNaz ile muamele eğer yoksa ilave edilmelidir.

b. Örneklerle İlgili Birime Verilmesi Gereken Bilgiler

1.RNA örneği, bu örneğe ait Bioanalyzer kromatogramını da içeren formlarla merkezimize teslim edilmelidir.

2. Bu analiz için teslim edilen örneklere ait bilgi ve sonuçlar birimimiz tarafından gizlilik esaslarına uygun olarak değerlendirmeye alınacaktır.

3. Birimimize teslim edilen RNA örneklerinin nitelik veya niceliği ile bu örneklere eşlik eden formlarda istenen bilgilerde eksiklik görülen örnekler işleme konmayacaktır.

 

 

 

c. Sonuçların Bildirilmesi

Normalizasyonu yapılmış sonuçlar birimimizde biriken isteklerin yoğunluğuna ve istenen analiz sayısına bağlı olmak üzere 2 hafta içinde istem yapana e-posta yoluyla veya posta ile basılı veya CD’ye kayıtlı olarak teslim edilecektir.

B. GENOM BOYU SNP ANALİZİ

Geniş ölçekli bağlantı analizleri, asosiyasyon (ilişkilendirme) ve kopya sayısı çalışmaları daha yoğun bir işlem hacmi ve herbir veri için çok daha düşük bir maliyete GeneChip Mapping Arraylerde gerçekleştirilebilir. Bu yüksek yoğunluklu arrayler 1.5 milyona kadar insan tekli nükleotid değişimi içermektedir.

 Kullanıma hazır Affymetrix SNP arrayleri şöyle sıralanabilir.

GeneChip 500K

GeneChip SNP 5.0

GeneChip SNP 6.0

Bu arrayler dışındaki uygulamalar, organizmalar için genom ölçeğinde analiz yapmak isteyenlerin özel tasarlanmış arraylere ihtiyaçları olacaktır. Affymetrix özel tasarlanmış arrayler üretmekte ve bunların tasarlanmasını yüklenmektedir.

 

a. Analiz Edilecek DNA Örneklerinin Asgari Nitelik ve Miktarı

Her bir örneğin bir çipe hibridizasyonu için gerekli DNA materyeli toplam miktarı 250ng’dır. Standardize edilmiş reaksiyon protokolleri gereği birimimize teslim edilecek DNA materyelinin konsantrasyonu 50 ng/ml olmalıdır.

Teslim alınacak DNA’ların %2’lik agaroz jeldeki görüntüsü ve 260/280, 260/230 spektrofotometrik absorbans oranları ile spektrofotometreden alınan konsantrasyon okumalarının çıktıları okumaları ile DNA materyeli ile beraber birimimize verilmelidir.

Birimimiz tarafından işleme konacak örneklerin:

A260/A280 oranı 1.7-2 arasında

A260/A230 oranı 2-2.5 arasında olması

Agaroz jel görüntüsünde degradasyon profili göstermemesi ve konsantrasyonlarının 50 ng/ml olması gerekmektedir.

 

b. Örneklerle İlgili Birime Verilmesi Gereken Bilgiler

1. Analizi istenen kalıp DNA’nın %2 jeldeki görüntüsü spektrofotometrik ölçüm sonuçları (konsantrasyon, A260/A280 ve A260/A230 oranları), birimimize DNA örneği ile beraber teslim edilmelidir.

2. Birimimize teslim edilecek DNA 50ng/ml konsantrasyonda toplam 500 ng miktarda olmalıdır.

3. Bu analiz için teslim edilen örneklere ait bilgi ve sonuçlar birimimiz tarafından gizlilik esaslarına uygun olarak değerlendirmeye alınacaktır.

 

 

c. Sonuçların Bildirilmesi

Sonuçlar birimimizde biriken isteklerin yoğunluğuna ve istenen analiz sayısına bağlı olmak üzere 2 hafta içinde istem yapana e-posta yoluyla veya posta ile yazılı veya CD’ye kayıtlı olarak teslim edilecektir.

This post is also available in: English