DNA RNA ve PROTEİN MANİPÜLASYONLARI

A. Bakteriden Plazmid İzolasyonu (Transfeksiyona Uygun)

Çoğaltılıp izole edilecek olan plazmid DNAsı, ya bakteri içinde veya agaroz jeldeki görüntüsü ile birlikte plazmid (3 µg) halinde merkezimize teslim edilmelidir. Plazmidin büyüklüğüne, içinde bulunduğu bakteri tipine ve plazmid kopya sayısına bağlı olarak izolasyon başına ortalama 200-500 µg transfeksiyona uygun plazmid DNAsı izole edilir, spektrofotometrik okuma değeri ve kantitatif agaroz jel fotoğrafı ile birlikte kullanıcıya teslim edilir.

– Mevcut yöntemle 50 kilobaza kadar büyüklükte olan kozmid veya plazmid DNAsı izole edilebilmektedir.

B. Hücre Kültüründen DNA, RNA veya Protein İzolasyonu

Merkezimizde memeli hücre kültür hatlarından genomik DNA, RNA veya total protein izolasyonu yapılmaktadır. Kazıyıcı ve soğuk PBS yardımı ile petri kabından sıyrılan 106 hücre iki kez soğuk PBS ile yıkanıp çökelti haline getirildikten sonra sıvı azot veya kurubuzda dondurulmalıdır. Her hücre hattı her biri 106 hücre içeren iki tüp halinde ve kurubuz içinde merkezimize teslim edilmelidir. Konsantrasyonları belirlenen DNA/RNA/protein örnekleri kurubuz içinde talep sahibine teslim edilir.

-Müteakip protokoller için başlangıç hücre sayısının artırılması gerekebilmektedir, örnekler yollanmadan önce merkezimize bu konuda danışılabilir.

C. İmmün çöktürme

Kazıyıcı ve soğuk PBS yardımı ile petri kabından sıyrılan 107 hücre iki kez soğuk PBS ile yıkanıp çökelti haline getirildikten sonra sıvı azot veya kurubuzda dondurulmalıdır. İmmün çöktürme için kullanılacak antikor ve analiz edilecek her hücre hattı her biri 107 hücre içeren iki tüp halinde, kurubuz içinde merkezimize teslim edilmelidir.

-Teslim edilecek antikor miktarı için merkezimize danışılmalıdır.

D. İmmün Emdirim (Western Blot)

Kazıyıcı ve soğuk PBS yardımı ile petri kabından sıyrılan 106 hücre iki kez soğuk PBS ile yıkanıp çökelti haline getirildikten sonra sıvı azot veya kurubuzda dondurulmalıdır. İmmün emdirim için kullanılacak primer antikor ve analiz edilecek her hücre hattı her biri 106 hücre içeren iki tüp halinde, kurubuz içinde merkezimize teslim edilmelidir. Bir jelde protein belirteci (marker) hariç 8 örnek analiz edilebilmektedir.

-Teslim edilecek primer antikor miktarı için merkezimize danışılmalıdır.

E. Rekombinant Protein Üretim ve Saflaştırılması

Rekombinant proteini ifade eden 5µg plazmid birimimize teslim edildikten sonra uygun bakteri içine transforme edilerek protein ifadesi optimize edilir. Rekombinant protein saflaştırıldıktan sonra talebe bağlı olarak proteindeki etiket (tag) uzaklaştırılır. Miligram seviyesinde izole edilen saf protein dializ edildikten sonra kurubuz içinde talep sahibine teslim edilir.

-İzlenecek stratejiyi belirlemek üzere birimimizle irtibata geçilmesi gerekmektedir.

F. cDNA Kütüphanesi Sentez ve Dizilemesi

Geleneksel cDNA kütüphanesi sentezi:

Talep sahibinin teslim ettiği RNA örneğinin integritesi kontrol edildikten sonra çift iplikçikli cDNA sentezlenmekte, daha sonra bu cDNA kütüphanesi pGEM-T vektör sistemine klonlanarak mavi koloni-beyaz koloni taramasına imkan verecek süperkompetan bakteri suşuna transforme edilmekte ve petri kaplarına ekildikten sonra talep sahibine teslim edilmektedir.
-Talep edilmesi durumunda bu kolonilerden plazmid DNA izolasyonu ve DNA dizi analizi gerçekleştirilebilir, bu konu için birimimizle irtibata geçilmelidir.

Yeni Nesil Sekanslama ile  cDNA kütüphanesi analizi:

Pek yakında hizmetinizde

This post is also available in: English