ROCHE LC480 EŞ ZAMANLI PCR SİSTEMİ

Gen ifadelenme oranlarının niceliksel olarak tayini amacıyla yapılan ve en güvenilir teknoloji olarak kabul gören Real-Time QRT-PCR’da bağıl niceleme (relative quantification) birimimiz tarafından Roche Light Cycler platformunda gerçekleştirilmektedir.

a. RNA Örneklerinin Nitelik ve Miktarı

RNA örneklerinin miktar, bütünlük ve temizlik dereceleri ifade profillemesi çalışmalarından alınacak sonuçların kalite ve güvenilirliği ile doğrudan ilişkilidir. Bu nedenle RNA örneklerinin değerlendirmelerinde birimimiz Agilent Bioanalyzer platformundan alınan kromatogram veya denatüre edici agaroz jelde yürütülüp fotoğraflanmış ve spektrofotometrik olarak konsantrasyon ve saflığı değerlendirilmiş yeterli temizlik ve miktardaki RNA örnekleri işleme konulacaktır.

Merkezimize kuru buz içinde getirilecek olan RNA örneklerinin Bioanalyzer’daki değerlendirmeleri istendiği takdirde yine birimimizde yapılabilir.

2 mg RNA’dan sentezlenecek 100 ml hacimdeki cDNA örneği ile 25 ml’lik 50 reaksiyon kurmak mümkündür. Birimimize teslim edilecek RNA miktarının bu bilgiye dayanarak hesaplanması gerekmektedir.

RNA örnekleri birimimize kuru buz içinde teslim edilmelidir.

İstenen kalitede RNA örneği elde etmek için kullanılabilecek tekniklere ilişkin detaylı bilgi için birimimize başvurulabilir. Kullanılan RNA izolasyon metodu ne olursa olsun izolasyon aşamalarına örnekteki DNA kontaminasyonunu ortadan kaldırmak üzere DNaz ile muamele eğer yoksa ilave edilmelidir.

b. Gen Spesifik Primerler/Housekeeping Gen Primerleri

İfade tayini yapılacak olan gen veya genlere ait primerler:

  • HPLC’de saflaştırılmış özellikte olmalıdır. MWG tarafından uygulanan HPSF veya Metabion tarafından uygulanan OPC eşdeğeri saflaştırma metodları kabul edilebilir saflıkta primerler verecektir.
  • 10 pmol/ml konsantrasyonda olmalıdır.
  • Reaksiyon başına herbir primerden (ters ve düz) 10 pmol olacak şekilde kullanılmaktadır. Teslim edilecek primer miktarının buna göre hesaplanması gerekmektedir.
  • Bu tür çalışmalarda sıklıkla kullanılan insan “housekeeping” genlerinden ACTB, B2M, GAPDH, HMBS, HPRT1, RPL13A, SDHA, UBC, YWHAZ ait primerler birimimizde mevcuttur. Nicelemeyi yapabilmek için gerekli insan “housekeeping” gen primerleri istendiği takdirde birimimiz tarafından sağlanabilir.

RT-PCR Primer Tasarımına Dair Önemli Notlar:

1.RT-PCR uygulamalarında kullanılacak olan primerlerin cDNA üzerinden amplifikasyon yaptıklarının kesinleştirilmesi için kullanılacak primerlerin farklı ekzonlar üzerinden (tercihen/eğer mümkünse bu iki ekzon arasına birkaç kilobaz girecek şekilde) tasarlanması tercih edilmelidir.

2. Primerlerin Tm’i 58-60oC arasında olması,

3. %GC içeriği %30-80 arasında olması,

4. Amplifiye edilecek bölgenin 100-150 bç arasında olması gerekmektedir.

QRT-PCR çalışmaları SYBR Green kitleri ile gerçekleştirilmektedir. Bu çalışmalar spesifik durumlarda ve özel taleplerde analizlerin problarla da yapılması istenebilir. Özel talepler için birimimizle görüşülmesi gerekmektedir.

c. Birime Örneklerle Beraber Verilmesi Gereken Bilgiler

1.RNA örneği, bu örneğe ait Bioanalyzer kromatogramı veya denatüre edici agaroz jeldeki görüntüsü ve spektrofotometrik okumaları da içeren formlarla merkezimize teslim edilmelidir.

2. Bu analiz için teslim edilen örneklere ait bilgi ve sonuçlar birimimiz tarafından gizlilik esaslarına uygun olarak değerlendirmeye alınacaktır.

3. Birimimize teslim edilen RNA örneklerinin nitelik veya niceliği ile bu örneklere eşlik eden formlarda istenen bilgilerde eksiklik görülen örneklerin işleme konmayacaktır.

d. Real-Time QRT-PCR sonuçları

Real-Time QRT-PCR  sonuçları birimimizde biriken isteklerin yoğunluğuna ve istenen analiz sayısına bağlı olmak üzere 2 hafta içinde istem yapana e-posta yoluyla veya posta ile basılı veya CD’ye kayıtlı olarak teslim edilecektir.

 

This post is also available in: English